今日最新什么是pcr技术(什么是PCR)

导读 您好,小编农农就为大家解答关于什么是pcr技术，什么是PCR相信很多小伙伴还不知道,现在让我们一起来看看吧！1、聚合酶链反应(Polymerase Ch

您好,小编农农就为大家解答关于什么是pcr技术，什么是PCR相信很多小伙伴还不知道,现在让我们一起来看看吧！

1、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

2、它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。

3、过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。

4、PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

5、 PCR技术简史 PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

6、 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。

7、其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

8、 PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是:①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。

9、②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。

10、此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。

11、这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

12、1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。

13、但每循环一次，仍需加入新酶。

14、1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。

15、此酶具有以下特点:①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。

16、②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。

17、③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。

18、由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。

19、为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。

20、此酶的发现使PCR广泛的被应用。

21、 PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

22、PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;②模板DNA与引 物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

23、每完成一个循环需 2~4分钟，2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

24、到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

25、 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。

26、反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。

27、Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。

28、平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。

29、反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

30、大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。

31、 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。

32、短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。

33、短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。

34、进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。

35、引物在与新链结合 时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。

36、不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

37、 PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系: 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10~100pmol 模板DNA 0.1~2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物: 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

38、理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

39、 设计引物应遵循以下原则: ①引物长度: 15-30bp，常用为20bp左右。

40、 ②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

41、 ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

42、ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

43、 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

44、 ⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

45、 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

46、 ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

47、 引物量: 每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

48、 酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。

49、催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

50、 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。

51、dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。

52、HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。

53、多次冻融会使dNTP降解。

54、在PCR反应中，dNTP应为50~200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。

55、浓度过低又会降低PCR产物的产量。

56、dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

57、 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。

58、 SDS的主要功能是: 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。

59、提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。

60、一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增。

61、RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

62、 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。

63、Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

64、 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

65、 温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

66、在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90~95℃变性，再迅速冷却至40 ~60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70~75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

67、对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

68、 ①变性温度与时间:变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

69、一般情况下，93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

70、此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

71、 ②退火(复性)温度与时间:退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

72、变性后温度快速冷却至40℃~60℃，可使引物和模板发生结合。

73、由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。

74、退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。

75、对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

76、引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度: Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5~10℃) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

77、复性时间一般为30~60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

78、 ③延伸温度与时间:Taq DNA聚合酶的生物学活性: 70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

79、 PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

80、PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。

81、3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。

82、延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

83、对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

84、 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。

85、PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。

86、一般的循环次数选在30~40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

87、 PCR反应特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为: ①引物与模板DNA特异正确的结合; ②碱基配对原则; ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性; ④靶基因的特异性与保守性。

88、 其中引物与模板的正确结合是关键。

89、引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。

90、聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。

91、再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

92、 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。

93、能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。

94、 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2~4 小时完成扩增反应。

95、扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

96、 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。

97、可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。

98、 PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。

99、PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

100、 凝胶电泳分析:PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。

101、PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。

102、 琼脂糖凝胶电泳: 通常应用1~2%的琼脂糖凝胶，供检测用。

103、 聚丙烯酰胺凝胶电泳:6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。

104、 酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

105、 分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。

106、 Southern印迹杂交: 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。

107、此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。

108、 斑点杂交: 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

109、 核酸序列分析:是检测PCR产物特异性的最可。

本文就讲到这里，希望大家会有所帮助。